微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的驗(yàn)證和確認(rèn)

制品微生物檢驗(yàn)方法主要分兩種類型，定性試驗(yàn)和定量試驗(yàn)。定性試驗(yàn)就是測(cè)定樣品中是否存在活的微生物，如無菌檢查及控制菌檢查。定量試驗(yàn)就是測(cè)定樣品中存在的微生物數(shù)量，如微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)。

制品微生物檢驗(yàn)方法是經(jīng)過驗(yàn)證的，只需要按照要求進(jìn)行方法適用性測(cè)試。

隨著微生物學(xué)的技術(shù)發(fā)展，一些領(lǐng)域引人了一些新的微生物檢驗(yàn)技術(shù)，如脂肪酸測(cè)定技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、基因指紋分析技術(shù)等。這些方法與傳統(tǒng)檢查方法比較，簡便快速或具有實(shí)時(shí)或近實(shí)時(shí)監(jiān)控的潛力。

（1）微生物定性替代檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證

①專屬性    微生物定性檢驗(yàn)的專屬性是檢測(cè)樣品中可能存在的特定微生物種類的能力。當(dāng)替代方法以微生物生長作為判斷微生物是否存在時(shí)，其專屬性驗(yàn)證時(shí)應(yīng)確認(rèn)所用培養(yǎng)基的促生長試驗(yàn)，還應(yīng)考慮樣品的存在對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。當(dāng)替代方法不是以微生物生長作為判斷指標(biāo)時(shí)，其專屬性驗(yàn)證應(yīng)確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)中的外來成分不得干擾試驗(yàn)而影響結(jié)果，如確認(rèn)樣品的存在不會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成影響。采用替代方法進(jìn)行控制菌的檢驗(yàn)，還應(yīng)選擇與控制菌具有類似特性的菌株作為驗(yàn)證對(duì)象。

②檢測(cè)限    微生物定性檢驗(yàn)的檢測(cè)限是指在替代方法設(shè)定的檢驗(yàn)條件下，樣品中能被檢出的微生物的特別小數(shù)量。由于微生物所具有的特殊性質(zhì)，檢測(cè)限是指在稀釋或培養(yǎng)之前初始樣品所含有的微生物數(shù)量,而不是指檢驗(yàn)過程中某一環(huán)節(jié)的供試液中所含有的微生物數(shù)量。

檢測(cè)限確定的方法是在樣品中接種較低濃度的試驗(yàn)菌（每單位不超過5cfu)，然后分別采用藥典方法和替代方法對(duì)該試驗(yàn)菌進(jìn)行檢驗(yàn)，以檢出與否來比較兩種方法的差異。試驗(yàn)菌接種量須根據(jù)試驗(yàn)而定，以接種后采用檢測(cè)方法50%的樣品可檢出該試驗(yàn)菌為宜。檢測(cè)限驗(yàn)證至少應(yīng)重復(fù)進(jìn)行5次。對(duì)于同一種試驗(yàn)菌可采用卡方檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)兩種方法的檢測(cè)限是否存在差異。

③重現(xiàn)性    重現(xiàn)性可視為微生物檢驗(yàn)方法在檢驗(yàn)結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測(cè)定該驗(yàn)證參數(shù)。在樣品中接種一定數(shù)量的試驗(yàn)菌（接種量應(yīng)在檢測(cè)限以上)，采用替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器)進(jìn)行檢驗(yàn)，采用卡方檢驗(yàn)(χ²）來評(píng)價(jià)兩種方法的重現(xiàn)性是否存在差異。驗(yàn)證過程中，應(yīng)關(guān)注樣品的一致性。

④耐用性    若替代方法檢驗(yàn)條件較為苛刻，則應(yīng)在方法中加以說明，應(yīng)單獨(dú)對(duì)替代方法的耐用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以便了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。

（2）樣品中微生物定量檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證

①準(zhǔn)確度   微生物定量檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度是指替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果與方法檢驗(yàn)結(jié)果一致的程度，通常用微生物的回收率（%）表示。

準(zhǔn)確度驗(yàn)證的方法:制備試驗(yàn)菌的菌懸液，菌懸液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的較高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/mL)。例如，菌落計(jì)數(shù)平皿法的替代方法，在制備高濃度菌懸液時(shí)其濃度是10³cfu/mL，系列稀釋至10° cfu/mL。每個(gè)試驗(yàn)菌應(yīng)至少選擇5個(gè)菌濃度進(jìn)行準(zhǔn)確度確認(rèn)，替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果不得少于方法檢驗(yàn)結(jié)果的70%，也可以采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法表明替代方法的回收率至少與方法一致。

②精密度    精密度驗(yàn)證的方法是:制備試驗(yàn)菌的菌懸液，菌懸液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確讀數(shù)的較高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/mL)。每個(gè)試驗(yàn)菌選擇其中至少5個(gè)濃度的菌懸液進(jìn)行檢驗(yàn)。每一個(gè)濃度至少應(yīng)進(jìn)行10次重復(fù)檢驗(yàn)，以便能夠采用統(tǒng)計(jì)分析方法得到標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

③專屬性    專屬性驗(yàn)證應(yīng)證明當(dāng)樣品中存在一定數(shù)量的試驗(yàn)菌時(shí),通過平皿法檢驗(yàn),能夠檢出試驗(yàn)菌，而樣品的存在不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。專屬性驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)能夠設(shè)計(jì)出可能使替代方法出現(xiàn)假陽性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠硖魬?zhàn)替代方法。當(dāng)替代方法不依賴微生物生長出菌落或出現(xiàn)混濁就可以定量時(shí)（如不需要增菌或在1～50cfn節(jié)圍內(nèi)就可直接測(cè)定的的定量方法)，以上驗(yàn)證方式就顯得更為重要。中凈環(huán)球凈化可提供潔凈廠房、GMP車間、生物實(shí)驗(yàn)室的咨詢、規(guī)劃、設(shè)計(jì)、施工、安裝改造等配套服務(wù)。

④定量限    定量限驗(yàn)證的方法是:在檢驗(yàn)范圍的低限制備5份不同含菌濃度的菌懸液，每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進(jìn)行不少于5次檢驗(yàn)，采用統(tǒng)計(jì)方法比較替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果與藥典方法結(jié)果的差異，從而評(píng)價(jià)替代方法的定量限。

⑤線性和范圍    線性驗(yàn)證時(shí)須覆蓋能夠準(zhǔn)確測(cè)定的所有濃度范圍。每株試驗(yàn)菌應(yīng)選擇至少5個(gè)濃度，每個(gè)濃度至少測(cè)定5次。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以檢驗(yàn)結(jié)果為因變量，以樣品中微生物的預(yù)期數(shù)量為自變量進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。替代方法的相關(guān)系數(shù)不得低于0.95。

微生物定量檢驗(yàn)的范圍是指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，檢驗(yàn)方法適用的高低限濃度或數(shù)量的區(qū)間。

⑥重現(xiàn)性    在樣品中接種一定數(shù)量的試驗(yàn)菌（接種量應(yīng)在定量限以上)，采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器)進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)來評(píng)價(jià)兩種方法的重現(xiàn)性差異。

⑦耐用性    替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必需的，但應(yīng)單獨(dú)對(duì)替代方法的耐用性進(jìn)行評(píng)價(jià),以便了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。

（3）檢驗(yàn)方法活用性

使用藥典方法進(jìn)行產(chǎn)品無菌檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

薄膜過濾法是取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天，其他各試驗(yàn)菌同法操作。

直接接種法是取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對(duì)照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天。

結(jié)果與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，應(yīng)消除供試品的抑菌作用,并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

（4）非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查

計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的原理主要是確認(rèn)樣品有無抑菌性，即確認(rèn)檢驗(yàn)樣品中的微生物能否在此培養(yǎng)基中正常生長。通常方法是在檢驗(yàn)樣品中加入代表類型的菌種（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，加菌量應(yīng)不大于100cfu)，各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。如果供試品對(duì)微生物生長具有抑制作用則需要采用適當(dāng)方法消除抑制作用。

（5）控制菌檢查方法適用性

控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物，應(yīng)根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株。

按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中;采用薄膜過濾法時(shí),取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，過濾后，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。如果上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查;若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

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